LUMEX实时荧光定量PCR应用---肉类掺假快速鉴别应用研究

 编者按

中国农科院质标所陈爱亮教授，研究方向主要为基于现代生物分析技术的食品质量安全快速检测、鉴别与溯源方法研究及产品研发等， 利用我司生产的微芯片实时荧光定量PCR仪在食品安全领域进行了大量科学研究，建立了一种基于芯片PCR的快速鉴别羊肉掺假成分的方法，其科研成果发表在《生物技术进展》2018年的第6期，特此向陈老师表示致敬，以下为陈老师发表文章《羊肉掺假鉴别快速荧光定量 ＰＣＲ 芯片制备及应用研究 》节选~~

随着社会经济水平的提高，我国居民饮食结构发生了重大的变化火锅、羊肉串等备受喜爱。然而，目前羊肉制品掺假现象愈发严重。常见的掺假肉类主要包括猪肉、鸡肉、鸭肉等有的甚至还会掺入鼠肉， 这种欺诈行为严重损害了消费者权益，同时对社会发展带来了消极影响。目前，研究人员已经开发出多种肉品掺假检测技术主要包括以蛋白质为基础的酶联免疫吸附、色谱质谱技术以代谢物为基础的红外光谱技术和以核酸为基础的ＰＣＲ检测技术等，其中应用多的为基于荧光定量ＰＣＲ的检测技术但是现有技术所需时间较长，无法满足现场快速鉴别的要求。同时，以羊肉串掺假为例，其掺假的肉类品种可能有猪肉、鸡肉、鸭肉、甚至老鼠肉等。如果逐个对可能的掺假物种进行ＰＣＲ检测则存在操作繁琐、分析时间长等问题。 

近年来，芯片式快速荧光定量ＰＣＲ技术的发展为羊肉掺假鉴别等核酸检测提供了一种快速多重的荧光定量ＰＣＲ检测方法其是一种将芯片技术与荧光定量ＰＣＲ技术相结合的高新生物技术。传统的微芯片技术是运用微电机系统技术通过制作微管道等空间结构及微加热等控制结构，实现芯片上的快速ＰＣＲ扩增而本研究通过将引物、反应所需试剂预先冻干固定到芯片上只需将模板滴加至微孔内即可进行扩增同时利用微芯片实时荧光定量ＰＣＲ仪实现通过荧光信号检测ＰＣＲ产物该技术也可应用于农业(植物病 原菌检测、转基因鉴别)、畜牧(牛类病害鉴别、鱼 类和家禽病原菌检测)、食品安全(病原菌鉴别、微生物腐*鉴别)、生命科学和医疗(人类疾病鉴别、人类基因检测)等领域。

为了建立一种基于芯片PCR的快速鉴别羊肉掺假成分的方法，将不同动物源性成分的引物及反应所需试剂预先冻干固定到空白芯片反应池内，以制备羊肉掺假鉴别快速荧光定量ＰＣＲ芯片，同时通过模拟掺假样品(在羊肉中掺入猪肉、鸡肉、鸭肉、鼠肉成分)检测实验，对所得芯片的性能进行了评价。从与ＡＢＩ７５００荧光定量ＰＣＲ结果对比可知，基于芯片的快速荧光定量ＰＣＲ检测方法可以准确检测５种动物源性成分，具有较高的准确性及可用性，且其ＰＣＲ扩增时间较短，操作简单，满足了羊肉掺假快速鉴别的要求，该芯片的研制及快速检测方法的建立将有效的简化羊肉制品掺假检测的步骤、缩短检测时间，且成本较低，仪器便于携带，使现场检测成为可能，研究结果为我国肉类食品安全监管提供了有力保障。

１.１　 材料与试剂 

羊肉、猪肉、鸭肉、鸡肉均购自北京市农贸市 场ꎬ鼠肉由中国农业科学院饲料研究所提供，二甲基亚砜、牛血清白蛋白、海藻糖等均购自北京雁栖湾生物技术有限公司

１.２　 实验仪器 

７５００荧光定量 ＰＣＲ 仪(美国 ＡＢＩ 公司)

ＡｒｉａＤＮＡ-１０便携式微芯片实时荧光定量ＰＣＲ仪 (ＬＵＭＥＸ 分析仪器公司)等

１.３　 样品制备 

用电子天平称取羊肉、猪肉、鸡肉、鸭肉、鼠肉各２０ｍｇ，用于提取引物特异性实验所用模板，再按照不同重量百分比(表１)分别称取不同肌肉组织进行混合作为模拟掺假样品(每份样品为２０ｍｇ)，总掺假比例为０~８０％。

１.４　 ＤＮＡ 的提取及检测 

按照ＴＩＡＮａｍｐＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡＫｉｔ说明书提取制备好的样品的基因组ＤＮＡ，采用超微量分光 光度计对提取的ＤＮＡ进行浓度及纯度检测ꎮ 其 浓度为１０~２０ｎｇ/μＬ，且纯度较高(Ａ２６０/Ａ２８０为 １.８~１.９，Ａ２６０/Ａ２３０>２.０)，因此可用于后续 ＰＣＲ 扩增。

１.５　 引物特异性实验

研究所用引物均由北京生工生物技术有限公司合成，为了确定引物特异性 在ＡＢＩ７５００仪器上分别用羊源、猪源、鸡源、鸭源与鼠源成分的特异性引物对５种肉的基因组 ＤＮＡ进行扩增反应体系(２０μＬ):２×ＰＣＲＭｉｘ １０μＬ１０ｍｏｌ/Ｌ正、反向引物各０.４μＬ，模板 ２ μＬ剩余用无菌去离子水补齐反应程序:９５℃ ５ ｍｉｎ９５℃ ３ ｓ６０℃ ３２ ｓ共 ４０ 个循环；７２℃ ２ ｍｉｎ 添加熔解曲线。通过扩增Ｃｔ 值(每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环 数)来判断引物的特异性，Ｃｔ<３５为有效扩增Ｃｔ ≥３５为无效扩增。

１.６.１ 芯片的制备　 

本研究的空芯片微阵列设计为５×６阵列，每个位点包含冻干固定的一对引 物(表３)及反应所需试剂。反应体系(２０μＬ):２×ＰＣＲＭｉｘ１０μＬ１０ｍｏｌ/Ｌ正、反向引物各０.４ μＬ，剩余体积用无菌去离子水补齐，同时将５μＬ ０.５ｇ/ｍＬＤＭＳＯ、１.６５~１.９５ｍｇ保护剂ＢＳＡ、０.６~ １.２ｍｇ赋型剂海藻糖与２０μＬ反应体系进行混合，随后取２μＬ混合溶液滴加到芯片上，采用 冻干机进行冻干(－４０℃冷冻 ２ ｈ)，置于４℃ 备用。

１.６.２　 芯片式ＰＣＲ反应　 

将２μＬ模拟掺假样品 １、２、３、４、５的基因组ＤＮＡ分别滴加到芯片的第 １、２、３、４、５列的反应池内，第６列为阴性对照，即不含任何模板。然后用６４０μＬ矿物油将液体覆盖，以免高温蒸发，此方法无需繁琐的配制体系与 操作步骤，简单快速ꎮ，反应程序:９５℃５ｍｉｎ，９５℃ ３ｓꎬ６０℃３２ｓ，ꎬ共４０个循环；７２℃ ２ｍｉｎ： 添加熔 解曲线。

２.１　 引物特异性实验 

引物的特异性是动物源性成分核酸检测技术的关键，本研究利用筛选出的羊源、猪源、鸭源、鸡 源与鼠源性成分的特异性引物对５种肉的基因组ＤＮＡ进行扩增。用羊源性引物进行扩增时，除了羊源ＤＮＡ出现扩增且所对应的 熔解曲线均为单峰外，其他物种模板均无扩增且 熔解曲线为平滑的一条直线，说明羊源性引物的特异性较好； 猪源、鸡源、鸭源与鼠源性引物与羊 的结果一致，表明５对引物特异性好，可用于后续实验。

２.２　 自制多重 ＰＣＲ芯片检测模拟羊肉掺假样品结果 

本研究利用自制的羊肉掺假鉴别多重 ＰＣＲ 芯片以及ＡｒｉａＤＮＡ-１０便携式微芯片实时荧光定 量ＰＣＲ仪对５种模拟掺假样品进行检测。各靶标的扩增Ｃｔ 值和扩增曲线分表见下表和下图。 

结合芯片式ＰＣＲ和ＡＢＩ７５００荧光定量ＰＣＲ 的结果可知：本研究所建立的扩增体系中在ＡｒｉａＤＮＡ-１０仪器上用芯片进行扩增时和ＡＢＩ７５００荧光定量ＰＣＲ检测方法的结果高度一致，２种方法均能准确的检测出５种成分，且随着动物源性成分含量的减少相应的Ｃｔ值会逐渐增加。要注意的是本研究无法通过Ｃｔ 值进行定量检测只能进行定性检测，即确定含有哪种成分的掺假。

根据５种模拟掺假样品的成分配比可知，每个样品中均含有羊源性成分。因此，采用羊源性引物对５种模拟掺假样品进行扩增时，共５条扩增曲线(图２Ａ)。 同理。猪源、鸡源、鸭源与鼠源性引物的位置分别出现４条、３条、２条与１条扩增曲线，结果与已知样品中所含成分保持一致。由于在实际应用中若掺假比例太低，则获利微薄。因此，本研究将低掺假比例设为２０％，未对含量更低的样品进行检测，从图２可以看出利用自制的ＰＣＲ芯片对５种模拟掺假样品进行检测均可检测到相应的动物源性成分，定性检测准确率 为１００％。同时，扩增曲线表明自制的ＰＣＲ芯片具有较好的扩增效率，而且随着动物源性成分含量的降低，相应的Ｃｔ 值逐渐增大。

本研究建立了基于芯片的快速荧光定量ＰＣＲ检测方法与传统的荧光定量ＰＣＲ相比，ＰＣＲ芯片一般由５×４或更多的反应池组成可实现样品多指标的检测。由于芯片式ＰＣＲ预先将反应所需试剂和引物冻干保存只需将提取的ＤＮＡ模板滴加到芯片上即可进行扩增简化了检测步骤、缩短了检测时间。通过与ＡＢＩ７５００荧光定量ＰＣＲ结果进行对比，发现两者的结果具有一致性，均可准确的检测出５种成分且Ｃｔ值均随着动物源性成分比例的减少而升高。目前，已有很多关于利用ＰＣＲ技术检测肉制品中掺假成分的报道Ｐｒｕｓａｋｏｖａ等采用多重ＰＣＲ扩增法可同时鉴别肉类产品中５种常见的掺假肉类。每种肉类的检测灵敏度可达３０ｐｇＤａｌｓｅｃｃｏ等采用荧光定量ＰＣＲ的方法可以检测１０种不同的动物源性成分ꎻ利用该方法对４６种实验肉品混合物进行了评价，结果显示所有品种均鉴定正确检测灵敏度为１％同时对１４种商业的肉类产品进行分析结果表明１４个样品中有６个含有鸡肉原料，由此可知，该方法对肉类产品的分析是有效和可靠的，普通ＰＣＲ虽然操作简单、成本较低，但是对产物进行电泳检测所需时间较长而传统的荧光定量ＰＣＲ一般需要２ｈ才能完成，不适用于现场检测。本研究所建立的芯片式荧光定量ＰＣＲ扩增法，由于所需样本体积小(只需２μＬ)ＰＣＲ升降温反应速度快，可缩短至３０ｍｉｎ完成扩增及数据收集，操作简单，实验周期短。该芯片的研制及快速检测方法的建立将有效的简化羊肉制品掺假检测的步骤、缩短检测时间，同时所用芯片检测仪器Ｌｕｍｅｘ体积较小，携带方便为现场检测提供了技术支撑。