LUMEX毛细管电泳仪应用--CIEF方法测定人血清蛋白与干扰素α-2b融合蛋白的等电点

 背景介绍

利用人血清白蛋白融合技术,制备一种在体内半衰期长,生物学活性高的长效研究重组人血清白蛋白.干扰素α2b融合蛋白,可用于病毒性肝炎,肿瘤等相关疾病的治疗.重组人血清白蛋白‐干扰素α2b融合蛋白是一种新型、长效、具有抗病毒、抗肿瘤及免疫调节作用的细胞因子，其半衰期较天然的干扰素α2b长且干扰素抗体的产生时间相对较晚，在临床上对患者的耐受性及依从性都较天然的干扰素α好。目前一些公司的同类生物制品已经进行到Ⅲ期临床试验阶段相应的质量控制方法和质量标准都有报道。

本次实验使用的样品为康宝集团客户提供的三个批次的重组人血清蛋白与干扰素α-2b融合蛋白样品（编号：rIFNα-2b-HAS 20161101、 rIFNα-2b-HSA 20161102、 rIFNα-2b-HSA 20161203），主要进行等电点的测定实验。

1.实验条件

仪器：LUMEX Capel 205 毛细管电泳仪

试剂：ADVANCED CIEF STARTER KIT试剂盒，Sciex 公司生产（试剂盒包含涂层的毛细管，pI 标记物和CIEF凝胶）。

毛细管条件：长度42 cm，内径 50 um，特殊涂层。

分析波长：280 nm

分析电压：25 kV

分析温度：20℃

分析时间：70 min

实验试剂：蒸馏水、200 mM 磷酸、300 mM 氢氧化钠、350 mM 乙酸、500 mM 精氨酸、200 mM 亚氨基二乙酸、3.75 M 尿素-Cief凝胶、尿素溶液和两性电解质 (Pharmalyte® 3-10)。

2.实验过程

实验时，首先进行毛细管的冲洗，对于本次使用的特殊的涂层毛细管不能用氢氧化钠等缓冲液冲液，需要用水、凝胶进行冲洗和活化。具体的试剂类型如下图所示：       

进口端和出口端溶液的放置

毛细管的润洗和分析程序如下图所示：

毛细管的润洗程序

分析条件

3.实验结果及分析

按照上述分析条件进行分析，在分析完成后会得到两张谱图，一张为聚焦的谱图，一张为分析的谱图，分析和定量主要是通过分析谱图。在本次实验中主要采用了三种pI marker 5.5，9.5 和10进行添加作为标准，对于*一批次的样品rIFNα-2b-HAS 20161101，分析图谱如下所示：

图中35min 左右的峰为pI为9.5 的marker的峰，51min左右的峰为pI为7.0 的marker的峰, 61 min左右的峰为5.5的marker的峰。三个marker出峰都比较明显，其中的第三个峰为样品的峰，迁移时间约为56 min左右。

通过*一批次三个marker 的迁移时间和pI值绘制标准曲线，曲线如下：

对于*一批的样品，通过对样品蛋白的积分，确定其保留时间并通过公式计算蛋白的pI值为6.05-6.14，其中大峰的pI值为6.05。

对于第二批次的样品rIFNα-2b-HAS 20161102，分析图谱如下所示：

图中33min左右的峰为pI 为9.5的marker的峰，50min左右的峰为pI 为7.0 的marker的峰, 59min左右的峰为5.5的marker的峰。三个marker出峰都比较明显，其中的第三个峰为样品的峰，迁移时间约为55 min左右。

通过第二批次三个marker 的迁移时间和pI值绘制标准曲线，曲线如下：

对于第二批的样品，通过对样品蛋白的积分，确定其保留时间（54.6、55、55.4 min）并通过公式计算蛋白的pI值为6.02-6.15，其中大峰的pI值为6.02。

对于第三批次的样品rIFNα-2b-HAS 20161203，分析图谱如下所示：

图中34 min 左右的峰为pI 为9.5 的marker的峰，51 min 左右的峰为pI 为7.0 的marker的峰, 60 min左右的峰为5.5的marker的峰。三个marker出峰都比较明显，其中的第三个峰为样品的峰，迁移时间约为55 min左右。

通过第二批次三个marker 的迁移时间和pI值绘制标准曲线，曲线如下：

对于第三批的样品，通过对样品蛋白的积分，确定其保留时间（56.5、56.9、57.3 min）并通过公式计算蛋白的pI值为6.03-6.15，其中大峰的pI值为6.03。

为了确认是否在5.5与4.1之间是否有其他的蛋白，将5种标记物都配制走样，图谱如下：

结果发现，在此条件下未出现明显的其他杂质蛋白，说明蛋白相对较纯。